Tolokonnikova zahájila kariéru politické aktivistky na jaře 2007, kdy se společně se svým manželem stala členkou radikální umělecké skupiny Vojna. Zúčastnila se několika jejich kontroverzních vystoupení, přičemž asi nejznámější je protestní akce „Mrdáme za Medvídka, dědice trůnu“, která se konala v únoru 2008 – den před zvolením Dmitrije Medvěděva ruským prezidentem. Tolokonnikova (ve vysokém stupni těhotenství) s manželem a dalšími páry provozovala ve veřejně přístupné muzejní místnosti v moskevském přírodovědeckém muzeu sex jako satiru na výzvu Medvěděva ke zvýšení reprodukce ruského obyvatelstva.

Od roku 2011 byla Tolokonnikova členkou punkové skupiny Pussy Riot. V srpnu 2012 byla spolu s dalšími členkami této skupiny odsouzena na dva roky vězení za výtržnictví v moskevské katedrále Krista Spasitele. Propuštěna byla v prosinci 2013 na základě amnestie ruského parlamentu. Poté ohlásila odchod ze skupiny. Spolu s Marií Aljochinovou na to založila občanské sdružení Zona prava, které má podle Wikipedie za cíl právní, psychologickou a informační podporu vězňů v Rusku a chce dosáhnout větší otevřenosti a humánnějších podmínek v celém ruském soudním a vězeňském systému.